揭示地钱精子功能中广泛存在的 N4胞嘧啶甲基化的关键作用

在生命的微观世界里，DNA 甲基化一直是科学家们密切关注的焦点。在原核生物中，DNA 甲基化以 N⁶ - 甲基腺苷（6mA）、N⁴ - 甲基胞嘧啶（4mC）和 5 - 甲基胞嘧啶（5mC）三种形式存在，它们在基因组防御和转录调控等方面发挥着关键作用。然而在真核生物领域，情况却复杂得多。6mA 在多细胞真核生物中的存在备受争议，其极低的检测水平常被认为可能是细菌污染所致；4mC 在真核生物 DNA 中的存在同样充满谜团，由于检测到的含量通常低于技术假阳性率，使得它的存在与否及功能都难以确定 。而 5mC 虽然在真核生物中较为普遍，但在一些模式生物中却又独立缺失。在植物的发育过程中，5mC 发挥着众多重要作用，例如在哺乳动物生殖细胞发育过程中，会发生大规模的 5mC 重编程，这对于促进细胞全能性和生殖功能至关重要；在开花植物的精子发生过程中，5mC 重编程也参与调节基因表达，进而推动生殖功能的实现。但地钱作为一种早期分化的陆地植物，其精子发生过程中的 DNA 甲基化机制尚不明晰，这就为科研人员提出了新的挑战和研究方向。
为了深入探索这些未知领域，来自英国约翰英纳斯中心（John Innes Centre）、奥地利科学技术研究所（Institute of Science and Technology Austria）等多个机构的研究人员展开了一项关于地钱（Marchantia polymorpha）精子发生过程中 DNA 甲基化动态和机制的研究。他们的研究成果发表在《Cell》杂志上，为我们揭示了许多重要的信息。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在样本处理方面，精心分离了地钱成熟精子以及处于精子发生后期的单个精子器。在检测分析上，综合采用了 RNA 测序（RNA - seq）、亚硫酸氢盐测序（BS - seq）、液相色谱 - 质谱联用技术（LC - MS）、单分子实时测序（SMRT - seq）等多种先进技术，从不同角度对样本进行深入分析，以获取全面且准确的数据。
研究结果如下：

1. 精子发生过程中的 DNA 甲基化重编程：研究发现地钱精子发生过程中存在两次广泛的 DNA 甲基化重编程浪潮。第一次，5mC 从转座子扩展到整个基因组，在精子发生过程中，转座子区域的胞嘧啶甲基化显著增加，非 CG（CHG 和 CHH）甲基化也从精子细胞阶段开始逐渐扩展，覆盖基因组的比例不断上升。第二次，在精子成熟的最后阶段，4mC 在基因区域广泛建立，CG 甲基化在此阶段大量增加，最终在成熟精子中占据基因组的 94%。并且，受精后精子的高甲基化状态会完全逆转，胚胎的甲基化模式与叶状体相似12。
2. 非 CG 甲基化重编程的机制：通过对甲基转移酶（Dnmts）转录动态的研究，发现 MpDNMT3b 和 MpCMTa 在精子发生过程中表达显著增加，且其表达模式与转座子甲基化增强和非 CG 甲基化扩展的时间相关。通过生成这两个基因的敲低突变体，证实了 MpDNMT3b 和 MpCMTa 介导了精子中的非 CG 甲基化重编程34。
3. 4mC 甲基转移酶的发现与验证：研究人员发现两个在精子发生后期特异性表达的基因 MpDN4MT1a 和 MpDN4MT1b，它们与原核生物的 N⁴胞嘧啶甲基转移酶聚类，且含有该酶催化域的特征序列。通过 DNA 斑点印迹免疫分析、LC - MS 等实验，证实了 MpDN4MT1a 是催化地钱精子中广泛 4mC 甲基化的关键酶，而 MpDN4MT1b 在这一过程中不起作用56。
4. 4mC 的分布特征：4mC 主要发生在 CG 环境下的基因区域，通过 BS - seq、SMRT - seq、4mC - Tet 辅助亚硫酸氢盐测序（4mC - TAB - seq）和载脂蛋白 B mRNA 编辑催化多肽样介导的脱氨测序（4mC - AMD - seq）等多种方法验证，发现转座子区域主要是 5mCG 甲基化，而基因区域则以 4mCG 为主，且 4mC 在基因区域的分布与 5mC 存在互补关系78。
5. 4mC 对精子功能的影响：4mC 在精子中的作用至关重要，它参与了精子成熟过程中的转录关闭。通过染色质可及性分析（ATAC - seq）和 RNA - seq 发现，4mC 缺失会导致精子染色质可及性增加，转录组发生改变。此外，4mC 还影响精子的运动性和生育力，Mpdn4mt1 - 1 突变体精子的运动速度和方向性明显降低，生育力显著下降，且受精后胚胎发育出现缺陷的比例增加910。
   在研究结论与讨论部分，该研究首次明确证实了 4mC 在真核生物地钱精子中的广泛存在及其重要功能。MpDN4MT1a 作为催化 4mC 的关键酶，其起源可能与细菌的水平基因转移有关，并且已经适应了真核生物基因组的功能需求。4mC 在精子基因区域的广泛存在，可能为受精后胚胎发育中父本基因组的识别提供一种机制，它的缺失会导致胚胎发育出现缺陷。此外，研究还发现地钱精子发生过程中的 DNA 甲基化重编程与哺乳动物配子产生过程中的 DNA 甲基化重编程存在相似之处，这表明表观遗传重编程在有性生殖中具有至关重要的作用 。不过，该研究也存在一定的局限性，例如目前对于 4mC 抑制染色质可及性和转录的机制尚不清楚，4mC 在胚胎发育过程中消失的机制也有待进一步研究。但总体而言，这项研究为我们深入理解真核生物 DNA 甲基化的功能和机制提供了重要的依据，拓展了我们对真核生物表观遗传学的认知，为后续相关领域的研究奠定了坚实的基础。