发布日期： 2025年06月20日
来源：Nature
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酶是大自然最精妙的分子机器，具有高效、专一和环境友好等特性。然而，人工设计能与天然酶媲美的人工酶一直是合成生物学和计算生物学领域的重大挑战。过去20年间，尽管计算酶设计取得了显著进展，但设计出的酶催化效率通常比天然酶低几个数量级，且往往需要依赖大量实验优化。Kemp消除反应作为质子转移的模型反应，因其缺乏天然催化酶而成为检验计算设计方法的"试金石"。然而，此前设计的Kemp消除酶催化效率(kcat/KM)普遍低于420 M-1s-1，催化速率(kcat)不超过0.7 s-1，远低于天然酶的中位水平(kcat/KM≈105 M-1s-1，kcat≈10 s-1)。
来自以色列魏茨曼科学研究所的Dina Listov等研究人员在《Nature》发表了一项突破性研究，开发了一套完整的计算设计流程，成功实现了高效Kemp消除酶的全计算设计。研究团队通过组合骨架组装、PROSS稳定化设计和FuncLib活性位点优化等创新方法，设计出了催化效率超越以往两个数量级的新型酶，最佳变体的催化参数达到天然酶水平。这一成果标志着计算酶设计领域的重要突破，为设计新型生物催化剂提供了可靠方法。
关键技术方法包括：(1)基于天然IGPS(吲哚-3-甘油磷酸合成酶)骨架的组合组装设计；(2)PROSS(蛋白质修复一站式服务)算法进行全局稳定化设计；(3)FuncLib(功能库)方法优化活性位点；(4)分子动力学(MD)模拟分析酶-底物相互作用；(5)经验价键理论(EVB)计算反应自由能。研究使用X射线晶体学验证了设计结构的准确性。
研究团队选择TIM桶折叠作为设计框架，开发了包含四个关键步骤的计算流程：首先通过组合骨架组装产生数千种骨架变体；其次应用PROSS进行稳定化设计；然后通过几何匹配定位催化位点并用Rosetta优化活性位点；最后进行核心和活性位点的稳定化设计。这一策略产生了73个设计，其中30个可溶性表达，20个具有可检测的Kemp消除活性。
研究聚焦于IGPS酶家族，设计的催化位点包含一个作为质子受体的Asp/Glu和一个与底物形成π堆积作用的芳香族残基。通过FuncLib优化，从初始设计Des27(131 M-1s-1)获得了12个变体，其中8个催化速率提高10-70倍。最佳变体Des27.7含有7个突变，催化效率达12,700 M-1s-1，kcat为2.85 s-1。晶体结构验证显示活性位点与设计模型高度吻合(全原子r.m.s.d.<0.5 Å)。
分子动力学模拟显示，关键突变Ile136Val、Ile216Val和Val183Ile通过增加催化Asp162周围的疏水堆积，改善其预组织和去溶剂化，从而提高反应性。底物在活性位点呈现两种反应构象："in"(硝基朝向桶内)和"out"(硝基溶剂暴露)，EVB计算表明两种构象都具有催化活性。Des27.7的底物保留时间是Des27的5倍，表明优化的活性位点口袋具有更好的底物识别能力。
通过系统解构各设计组件的贡献，研究发现：(1)模块化组装对产生多样化骨架至关重要；(2)PROSS稳定化设计显著提高热稳定性(Tm从57°C升至85°C)；(3)活性位点设计不仅不损害稳定性，反而与之协同增效。最引人注目的是，将设计中的关键芳香族残基Phe113突变为Leu后，催化效率进一步提升至123,000 M-1s-1，kcat达30 s-1，打破了"芳香族残基对底物结合至关重要"的传统认知。
这项研究实现了计算酶设计领域的重大突破，首次在不依赖实验优化的情况下设计出催化效率与天然酶相当的人工酶。通过系统整合骨架多样性设计、全局稳定化方法和活性位点优化策略，研究团队证明了当前原子尺度设计方法已足够可靠，能够直接在天然折叠中设计高效酶。特别值得注意的是，该研究不仅解决了技术难题，还通过精心设计的实验揭示了酶催化的一些基本原理，如活性位点预组织、多构象底物结合模式等对高效催化的贡献。最佳设计Des27.7的催化参数(kcat/KM>105 M-1s-1，kcat=30 s-1)达到了天然酶的中位水平，远超此前所有计算设计的Kemp消除酶。这一成果为设计更复杂的"自然界中不存在"的酶奠定了基础，对合成生物学、绿色化学和生物制造等领域具有重要意义。
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