京都大学开发iPSCs衍生的肾类器官

研究人员已经产生了诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肾类器官来模拟由COL4A5基因突变引起的Alport综合征，并证明了化学伴侣蛋白的效用，以挽救由突变引起的蛋白质错误折叠和胶原蛋白错误组装。这项研究发表在《Communications Biology》杂志上。

据估计，在美国和欧洲，阿尔波特综合症(AS)的发病率分别为5000分之一到5万分之一，而在日本，估计约有1200人患有这种疾病。它是遗传性肾小球肾炎的第二常见形式，由几个基因(COL4A3、COL4A4或COL4A5)突变引起，这些基因在肾脏肾小球基底膜(GBM)中形成一种特殊类型的胶原(即α3α4α5[IV]胶原)，并在生命早期表现为终末期肾病(ESRD)。

不幸的是，由于缺乏体外模型来推断和纠正AS患者胶原蛋白组装缺陷，目前尚无根治性治疗方法，其致病机制也未完全了解。

由Kenji Osafune教授(细胞生长与分化系)领导的中国CiRA和大正制药有限公司的研究小组从两名x连锁AS患者身上制造了iPSCs，以生产肾脏类器官。具体来说，神户大学的一组医生收集了一名由COL4A5基因G545D错义突变引起的轻度AS患者和另一名由T552Sfs*6移码突变引起的严重AS患者的血液样本，该突变产生了用于iPSC生成的截断的胶原α5(IV)蛋白。

研究小组还利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统制作了一个AS突变纠正的iPSC系，以逆转轻度AS患者的COL4A5 G545D错义突变。基于先前报道的经过一些修改的分化方案，他们通过患者特异性和健康对照iPSCs衍生的肾细胞祖细胞产生了肾类器官。

值得注意的是，研究人员观察到，机械搅拌的肾类器官的自由漂浮培养有助于促进它们的成熟，这是本研究的一个关键特征，因为在肾脏发育过程中，GBM胶原组成从α1α1α2(IV)转变为α3α4α5(IV)异源三聚体。

因此，研究人员能够产生表达α5(IV)胶原的肾类器官，并在健康和突变纠正的轻度As iPSCs衍生的肾类器官的GBM样结构中观察到胶原α3α4α5(IV)。然而，反映临床表型的是，轻度和重度AS iPSCs衍生的肾类器官表达α2(IV)而不表达α5(IV)胶原。

进一步的透射电子显微镜分析显示，轻度和重度AS肾类器官均未显示出先前在成年AS模型(Col4a5 G5x突变体)小鼠中观察到的一些特征性GBM超微结构异常，这表明这种超微结构变化可能需要进一步成熟才能完全表现出来。

尽管如此，由于肾类器官已经达到了一个发育阶段，可以重现IV型胶原的异构体转换，研究人员可以区分来自轻度和重度AS病例的患者特异性iPSCs产生的肾类器官之间的差异。具体来说，COL4A5表达仅在严重AS肾类器官中降低，类似于COL4A5突变小鼠中观察到的下调，可能是由疾病相关转录物的无义介导的衰变(NMD)造成的。

然而，引起轻度AS的G545D突变不太可能引发NMD，因此，COL4A5的表达在由轻度AS iPSCs产生的肾类器官中不受影响。此外，α3(IV)胶原蛋白在轻度AS肾脏类器官中检测到，而在严重AS肾脏类器官中，尽管在RNA水平上表达正常，但未见α3(IV)胶原蛋白。以往的临床研究表明，在表现为轻度症状的AS患者中可检测到α3(IV)或α5(IV)蛋白，这说明肾类器官可以准确地模拟轻、重度AS病理的各个方面。

胶原异三聚体通常聚集在内质网(ER)，并由高尔基体分泌到细胞外空间。由蛋白质错误折叠引起的组装缺陷会引起内质网应激，并引发未组装或错误组装的胶原的自噬降解。

由于先前的一项研究已经证明了化学伴侣通过减轻蛋白质错误折叠来减少由COL4A2突变引起的患者原发性真皮成纤维细胞中细胞内胶原积累和内质网应激的潜力，研究人员研究了类似的方法是否可以逆转由AS COL4A5突变引起的肾类器官中观察到的一些异常。

为了验证这一点，他们用几种低分子量化学伴侣，4-苯基丁酸(4-PBA)，三甲胺n -氧化物(TMAO)和甘露醇处理轻度AS肾类器官，并观察到α5(IV)胶原蛋白在4-PBA处理的突变GBM样结构中，从而突出其作为AS治疗的可行治疗策略的潜力。

总之，这项合作努力成功地产生了一个体外疾病模型，以再现AS病理的几个关键方面。有了这个新的实验系统，研究人员现在可以阐明这种使人衰弱的疾病的详细致病机制，并预测对新疗法的治疗效果。