精准医疗设想在正确的时间将正确的药物提供给正确的细胞。这种方法彻底改变了癌症治疗，根据特定的突变或其他分子特征来设计针对肿瘤的药物。鉴于精准医学方法在肿瘤学领域的成功，将类似的策略应用于脑部疾病——只对需要治疗的脑细胞提供治疗而不影响健康的脑细胞——将是革命性的。肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的主要特征之一是神经元亚群中的RNA结合蛋白TDP-43的功能丧失。来自英国伦敦大学学院的研究人员描述了一种治疗运动神经元疾病——肌萎缩侧索硬化症(ALS)的精确医学策略：递送合成的“隐式”外显子，仅在显示ALS特征的细胞中驱动基因表达，为神经退行性疾病的精准医学策略铺平了道路。

肌萎缩侧索硬化症是一种毁灭性的神经退行性疾病，由大脑和脊髓的运动神经元选择性丧失引起。这种疾病有许多不同的潜在遗传和环境因素，但几乎所有ALS患者的神经系统都有一个共同的分子特征——细胞核中一种叫做TDP-43（TAR DNA-binding Protein)的RNA结合蛋白的缺失。这一分子事件改变了数千个RNA的正常处理过程，导致神经元功能障碍。TDP-43 (TDP-LOF)功能丧失也是多种其他神经退行性疾病的标志。

TDP-43缺失导致一种与隐外显子剪接出错有关的RNA加工事件。我们都知道正常细胞中成熟的mRNA中通常不包括内含子中的DNA序列，TDP-43结合在这些隐外显子附近，并确保它们被剪接出来。当TDP-43从细胞核中丢失时，这种抑制就会丢失，成熟的mRNA中就保留了隐外显子（ cryptic exons）。那些对神经元功能至关重要的基因或携带疾病风险变异的基因中若保留多余的隐外显子，会引起阅读框移码、降低RNA稳定性、或产生新的蛋白质同种异构体。这些发现为ALS的研究开辟了新的方向，包括探索作为潜在生物标志物的隐剪接事件（cryptic splicing events）及治疗靶点。

但在ALS患者中并不是所有的神经元都有TDP-43缺陷，所以挑战之一是只靶向那些具有TDP-43病理的神经元，而不是那些具有正常TDP-43功能的神经元，避免进一步恶化病情。

如何找出一种方法来区分TDP-43功能丧失的细胞和TDP-43功能正常的细胞？作者聪明地意识到，他们可以利用TDP-43功能丧失的结果：隐外显子作为一种传感器，来检测TDP-43何时何地功能失调，然后只对这些缺陷细胞进行治疗。作者首先设计一种仅当TDP-43功能失调时能在细胞中开启红色荧光蛋白表达的结构——构建了一个包含编码红色荧光蛋白序列的嵌合基因，在具有正常TDP-43功能的细胞中隐外显子被移除会阻止荧光蛋白质产生；但在没有TDP-43的细胞中隐外显子保留了下来，使荧光蛋白得以产生。他们将这种嵌合基因引入经过改造的人类细胞系中，通过药物来关闭TDP-43时细胞发出红光。作者将该系统命名为TDP-REG，因为它允许他们利用TDP-43作为基因表达调节器的功能，可根据剪接变化，实现疾病特异性基因治疗表达的空间和时间调控。

验证了TDP-REG工具，作者尝试用它来纠正与ALS相关的单个隐剪接事件。他们用一种经过修饰的Cas9酶代替了荧光蛋白，这种Cas9酶允许进行靶向基因组编辑。

他们首先对编码UNC-13同源蛋白的UNC13A基因进行“搜索和替换”编辑，阻断了TDP- 43缺陷神经元中UNC13A基因的隐外显子，使之在没有TDP- 43的情况下成熟UNC13A mRNA也不包含隐外显子，维持缺陷神经元中UNC13A蛋白的正常水平。这是v1版。

然后，作者对TDP-REG进行了修改：不仅一次修复一个TDP-43调节的隐外显子，而且能同时纠正多个隐外显子。他们通过使用TDP-43和核糖核蛋白PTB结合1 (RAVER1)蛋白的剪接抑制域之间的融合蛋白实现了这一目标。这项工作建立在先前使用类似方法的研究基础上，并将这一策略扩展到只在那些需要它的神经元——即那些失去TDP-43功能的神经元——中激活，避免了健康神经元中过多的TDP-43的潜在有害影响。

肌萎缩侧索硬化症是一种具有毁灭性的侵袭性和快速发展的疾病，一旦做出诊断，治疗可能为时已晚，无法发挥作用。文章介绍的这种优雅的治疗策略，可以在需要治疗的神经元而不是不需要治疗的神经元中纠正ALS的病理。由于TDP-REG内置的安全功能，作者设想有患病风险的患者(可能是因为遗传易感性因素)在症状前阶段接受这些治疗之一，在此阶段它处于休眠状态，直到TDP-43功能障碍被激活。TDP-REG的模块化设计策略也可能支持未来的修改，以针对新的疾病相关病理、细胞类型和细胞状态，因为它们被发现。这项工作使我们离神经退行性疾病(如ALS)的精准医学治疗又近了一步。

鉴于TDP-LOF功能缺失是ALS、FTD和其他常见神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病和LATE)的标志，TDP-REG可能在这些疾病的治疗中具有广泛的用途。在单细胞分辨率下，疾病诱导的基因疗法激活可能有助于减轻患者永久转基因表达的潜在风险。此外，在携带ALS因果遗传变异的高危个体中，TDP-REG的空间和时间特异性可以使治疗药物在症状前阶段进行，直到检测到TDP-43病理的第一阶段。此外，TDP-REG可用于药物开发的临床前阶段，作为细胞甚至活体动物中TDP-43病理的实时读数。

TDP-REGv1涉及转基因与上游调控模块的融合，具有源自现有人类基因的修饰隐外显子序列。这种方法有几个好处：作为模块化设计，不同的转基因可以由相同的上游调控模块控制。此外，TDP-REGv1是基于经过充分验证的、以疾病特异性方式在患者中检测到的内源性隐外显子。

相比之下，TDP-REGv2使用嵌入转基因序列本身的合成剪接传感器。这解决了TDP-REGv1和以前方法的几个局限性:它不需要长时间的上游调控区域，从而有助于将大型转基因包装成AAV载体；它阻止上游不需要的肽被表达并释放到细胞中，而且它是高度可调的，这意味着剪接特性可以针对所传递的特定转基因进行优化。

拼接规律是一个非常复杂的问题，难以用传统的算法进行预测。在TDP-REGv2的开发过程中，作者创建了一个名为SpliceNouveau的算法，该算法利用深度学习拼接预测和合理设计原则来优化向量，帮助确保它们以所需的方式拼接。使用SpliceNouveau成功设计了当TDP-43存在时优先使用的竞争性替代剪接位点，成功地生成了隐式盒外显子和隐式替代剪接位点。SpliceNouveau设计的载体的灵活性和高成功率代表了剪接调节载体技术的重大进步。

这项研究证明了如何反向利用驱动ALS和FTD进展的隐剪接，以实现靶向异常细胞的治疗性蛋白表达。这种方法与先前已被批准用于基因治疗的传统AAV兼容，可以很容易地适用于不同的转基因，包括调整其最大表达和对TDP-43缺失的敏感性。这将最大限度地减少毒副作用的风险，从而提高在临床试验期间获得可衡量改善的机会，减少患者的危险。