基因表达的控制从根本上来说是蛋白-DNA的相互作用。这些相互作用可通过生化分析轻松地弄清，如凝胶阻滞分析。但如果研究人员想知道基因组DNA的特定部分是否参与，通常会选择染色质免疫沉淀技术（ChIP）。
ChIP是在全基因组范围内识别DNA与蛋白质相互作用的标准方法，最初用于组蛋白修饰研究，后来也用于转录因子。整个实验涉及到一系列蛋白质组学和分子生物学的方法，包括交联、细胞裂解、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA样品的纯化以及qPCR等分析。实验从原理上说虽很简单，但要想成功，却并不容易。下面就让我们一起来扫清ChIP实验的技术障碍吧。
第1步：交联
ChIP分析是从蛋白-DNA复合物的共价稳定开始的。许多蛋白-DNA的相互作用是瞬时的，涉及到多个蛋白复合物。体内（in vivo）的交联稳定了蛋白-DNA复合物。若没有交联的步骤，则意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白才能被免疫沉淀，譬如组蛋白。若您的研究对象是组蛋白，那可能不需要交联，而其他蛋白（如转录因子）还是需要交联。 如果使用交联，则ChIP反应被称为X-ChIP，而天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而，确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式，因为在交联过程中它们的表型会发生变化，或出现包涵体。 体内交联通常是利用甲醛来实现的，但也可以与其他的交联剂（如EGS和DSG）结合使用。甲醛交联适用于两个直接相互作用的分子。然而，甲醛是零长度（zero-length）的交联剂，这限制了其功能。对于更复杂的相互作用，我们可以选用更长的交联剂，如EGS（16.1埃）或DSG（7.7埃），以便捕获更大的蛋白复合物。 第2步：细胞裂解 裂解过程从细胞或组织中提取出交联的蛋白-DNA复合物，让它们进入溶液。在这一阶段，通过去污剂溶液来溶解细胞膜，从而释放细胞组分。蛋白-DNA相互作用主要发生在核内，故去除胞浆蛋白可降低背景，并提高灵敏度。去污剂或盐的存在不会影响蛋白-DNA复合物，因此上一步中实现的共价交联将在整个ChIP过程中保持复合物稳定。 一般不建议使用机械裂解，因为细胞核裂解的效率不高。我们可使用一些试剂将细胞核与其他细胞组分分离，从而消除背景信号，提高灵敏度，比如Pierce Chromatin Prep Module。 第3步：染色质制备（剪切/消化） 为了分析与蛋白结合的序列，所提取出的基因组DNA必须剪切成更小的片段。DNA片段化通常是利用超声波处理或微球菌（MNase）的酶切消化来实现的。 理想的染色质片段在200至>1000 bp，但DNA剪切是最难控制的步骤之一。对于X-ChIP，超声波处理是必需的，因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理带来了真正随机的片段，但需要使用专门的仪器，也有一些限制，包括需要优化、在处理过程中难以维持温度。微球菌消化的重复性好，可处理多个样品，但酶活也可能存在差异。 第4步：免疫沉淀 为了分离特定修饰的组蛋白、转录因子或辅助因子，我们需要使用ChIP级别的抗体来进行免疫沉淀，并从其他核组分中分离目标。这一步选择性富集蛋白-DNA复合物，并去除其他无关的细胞组分。 人人都说，抗体的正确选择是ChIP分析成功的一个关键因素，因此这一步可不能掉以轻心。市场上的抗体很多，但并非每一个都适合ChIP，这主要取决于抗体识别哪个表位。例如，有些抗体在三维背景下识别它们的抗原，而另外一些只能识别变性蛋白。对于后者，它们可能适合Western blot，而不是ChIP。 许多公司提供ChIP级别的抗体。赛默飞世尔旗下的Pierce大约提供100多种经ChIP验证过的抗体。默克密理博也提供近90种ChIPAb+™抗体。据介绍，ChIPAb+™抗体每一批、每一次都经过染色质免疫沉淀的验证。它们经过已知阳性和阴性位点的验证，并带有配对的IgG阴性对照和PCR引物。对于ChIP新手而言，ChIPAb+ 显然是再适合不过了。 当然，并非所有目标蛋白都有相应抗体可选。怎么办？你只能自己验证，在ChIP中使用它。默克密理博有一种组蛋白肽段芯片AbSurance™，能帮助研究人员确定抗体的特异性。AbSurance是一对PVDF膜；第一张包含组蛋白H3前导肽的46种修饰形式，而第二张包含组蛋白H2A、H2B和H4的44种形式。每个肽段都有100 ng和10 ng两种浓度。 利用AbSurance这种芯片，你可以确定识别组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化的抗体是否能识别另一组蛋白上另一位置的同样修饰，或相同氨基酸的单个或二甲基化修饰。了解抗体的特异性将有助于我们在实验设计时做出更明智的选择。 现在，抗体-蛋白-DNA这个复合物可利用抗体结合树脂来亲和纯化，如蛋白A、蛋白G或蛋白A/G。对于生物素化的抗体，也可以采用固定化的链霉亲和素。若要降低背景，有必要用核酸和蛋白封闭液来封闭抗体结合磁珠。每个ChIP样品中的磁珠用量也会影响背景，因为磁珠量的增加会增加非特异结合。 第5步：解交联和DNA纯化 富集与目的蛋白结合的DNA是染色质免疫沉淀的目标。DNA水平一般可通过实时定量PCR（qPCR）来测定。在DNA被扩增之前，必须解交联。这通常是利用加热孵育或蛋白酶K的消化来实现的。 蛋白酶K常用于DNA或RNA制备过程中以去除蛋白质。此外，蛋白酶K的使用也去除了核酸酶，防止DNA被降解。在DNA分离过程中，可使用酚-氯仿再加标准的DNA纯化方法。当然，我们也可以使用相关的纯化试剂盒。 第6步：DNA定量 目前最常用的方法就是通过定量PCR来定量纯化所得的DNA产物。qPCR既可以作为一种读数分析，也可以在测序或芯片分析之前，作为ChIP后DNA的质量控制。 据Pierce蛋白功能产品的市场部经理Rizwan Farooqui介绍，大约75%的研究人员使用qPCR，因为每个人都能接触到qPCR仪器。而一小部分（大约10%-15%）研究人员使用测序（ChIP-Seq），其余的使用芯片（ChIP-on-chip）。 这些方法之间的区别在于它们所产生的数据量以及方法是否是靶向的，qPCR和ChIP-on-chip是，而ChIP-Seq不是，不过就ChIP方法本身而言，或多或少都是相同的。 对于新手而言，采用试剂盒是个明智的选择。虽说比较贵，但贵有贵的道理，配齐了大部分试剂，有一个流畅的protocol，附带阳性和阴性对照，不需要反复优化，省时省心。当然，在您熟练掌握了ChIP操作之后，就可以自由发挥了。 新的ChIP试剂盒也在不断上市。赛默飞世尔在今年就推出了一个Magnetic ChIP Kit，以顺磁珠来取代琼脂糖珠进行免疫沉淀。据介绍，磁珠省去了离心步骤，能简化ChIP处理，在高通量研究中特别有用。此外，Magnetic ChIP Kit也更为灵敏。 默克密理博在今年5月也推出了Magna ChIP® HiSens染色质免疫沉淀试剂盒。从字面上可以看出，这是个高灵敏度的试剂盒。它能够处理低至10,000个细胞，而传统试剂盒通常需要1x106个细胞。它带来了低背景、高信噪比，以及超灵敏的检测，与各种下游应用兼容。 值得一提的是，这款试剂盒采用单缓冲液系统，即超声处理、ChIP和洗涤步骤都采用一种缓冲液。这种简化的方法，再加上蛋白A/G磁珠，不仅实现了更广范围抗体亚型的ChIP，还带来了低背景和高信噪比。 ChIP是门很深的学问。也许你心中还有不少疑团，建议你读一读默克密理博专家撰写的《Guide to Chromatin Immunoprecipitation: Critical Factors for Success》，相信会受益匪浅。（生物通 余亮）
