测试数千种RNA酶有助于在哺乳动物中发现第一个“扭曲核酶”

宾州大学公园“RNA世界”假说提出，地球上最早的生命可能是基于RNA——一种在许多方面与DNA相似的单链分子——就像一些现代病毒一样。这是因为，像DNA一样，RNA可以携带遗传信息，但像蛋白质一样，它也可以作为一种酶，启动或加速反应。虽然一些核糖核酸酶（核糖酶）的活性已经在个案基础上进行了测试，但通过计算预测，从细菌到植物和动物的生物体中存在着数千种以上的核糖核酸酶。现在，宾夕法尼亚州立大学的研究人员开发了一种新方法，可以在一次实验中测试数千种预测核酶的活性。

研究小组测试了2600多种不同的RNA序列的活性，这些序列被预测属于一类被称为“扭曲核酶”的RNA酶，这种酶有能力将自己切成两半。大约94%的测试核酶是活跃的，研究表明，即使它们的结构有轻微的缺陷，它们的功能也能持续存在。研究小组还在哺乳动物中发现了第一个扭转核酶的例子，特别是在宽吻海豚的基因组中。

这篇描述这项研究的论文发表在11月5日的《核酸研究》杂志上。

“DNA是一种双链分子，通常形成简单的螺旋结构，而RNA是单链分子，可以自我折叠，形成多种结构，包括环状、凸起和螺旋，”宾夕法尼亚州立大学埃伯利科学学院化学、生物化学和分子生物学杰出教授、研究小组负责人菲尔·贝维拉夸（Phil Bevilacqua）说。“RNA酶的功能是基于这些结构的，它们被分为几个不同的类别。我们选择专注于所谓的‘扭曲核酶’，因为它们的功能之一是将自己一分为二，我们可以通过确定它们的基因序列来看到这一点。”

在这项研究之前，基于基因组序列和对结构的预测，已经提出了大约1600种扭转核酶，但只有少数得到了实验验证。该团队开发了一种实验管道，使他们能够在一次实验中评估数千种核酶的自切割活性，他们称之为“切割高通量测定”，简称CHiTA。他们还通过精心手工搜索1000种生物体基因组中许多核酶共享的短而高度保守的序列的基因组背景，确定了大约1000种额外的扭转核酶候选物。

CHiTA依赖于两个关键因素。一种是最近开发的一种技术，称为“大规模平行寡核苷酸合成”（MPOS）。MPOS使研究团队能够设计并购买数千种不同的核糖酶序列，这些序列以DNA小片段的形式存在于一个小瓶中。他们设计的每一个序列都以2600个预测的核酶序列中的一个为核心。然后，研究人员在两端添加短段DNA，使他们能够复制DNA并将其转录成RNA以测试其活性。

“有了MPOS，我们可以简单地用我们感兴趣的序列创建一个电子表格，把它发送给商业供应商，他们给我们寄回一个包含每个序列少量的试管，”劳伦·麦金利（Lauren McKinley）说，她是宾夕法尼亚州立大学（Penn State）的研究生，最近获得了博士学位，是该论文的第一作者。“对于CHiTA，我们需要大量的每个序列，所以我们在序列的每一端添加DNA片段，使我们能够使用一种称为PCR的技术制造数百万个副本，但这些额外的片段可能会影响我们测试核酶功能的能力。”

CHiTA的第二个关键因素有助于克服这一障碍，它使用一种称为限制性内切酶的蛋白质去除这些附加的序列片段，这种蛋白质在称为识别位点的特定短序列上切割DNA。然而，大多数限制性内切酶在其识别位点的中间附近切割DNA，留下一部分识别位点序列附着在两个产生的DNA片段上，这仍然可能影响核酶的结构和功能。

麦金利说：“我们发现了一种限制性内切酶，它可以在距离识别位点很近的地方切割DNA，所以我们可以设计我们的序列，这样它就不会留下额外DNA的痕迹。”“通过这种方式，我们可以确保我们正在评估核酶精确序列的功能。”

在实验室里，研究小组首先对通过MPOS排序的序列进行额外的复制，用限制性内切酶修剪任何额外的DNA，然后他们可以从DNA序列中转录RNA。如果其中任何一个序列编码活性核酶，当RNA产生时，它们将迅速折叠成其功能结构并自我切割。然后，研究人员可以收集RNA并将其转化为DNA（称为cDNA），这样他们就可以读取其序列，看看它是全长还是已被切割。麦金利说：“当我们对cDNA进行测序时，我们可以看到有多少RNA被切割，如果有的话，作为核酶活性的一个指标。”“在我们测试的大约94%的序列中，相当一部分RNA被切割。事实上，每种活性核酶被切割的百分比与早期单独测试核酶的努力非常相似。”

然后，研究小组观察了他们测试的序列的预测结构，发现其中许多序列与标准的扭曲核酶结构相比有轻微的变化或缺陷，但它们仍然是自裂的。这向研究人员表明，核酶的功能对轻微的结构变化非常耐受，这意味着即使结构不完美，它们仍然可以起作用。

研究小组认为，对不完美的容忍表明，自然界中可能隐藏着更多的扭曲，而这些扭曲是使用原始搜索参数无法发现的。事实上，在这项研究中，基于序列的新描述符使研究小组发现了第一个哺乳动物的扭转核酶，这是在宽吻海豚的基因组中发现的。

Bevilacqua说：“了解这些类型的对核酶序列和结构变化的耐受性将有助于我们设计新的和严格的方法来识别它们。”“我们目前对核酶功能的了解主要基于化学，我们才刚刚开始了解它们在生物学中的作用。能够在像CHiTA这样的大规模试验中测试它们的活性，将有望加快我们发现新的核酶的能力，并更好地了解它们在细胞中所起的作用。所有这些也可以帮助我们及时回溯，看看当RNA的能力可能是早期地球生命启动的关键时，可能会发生什么。”