要寻找能更有效包装“货物”、或者更高转导效率的病毒类递送载体，通常的做法是利用病毒基因组突变文库定向筛选的实验室定向进化。但是，所有定向进化系统都需要一种方法，在进行特定属性的选择之后能确定所需的突变体。由于eVLPS没有包装任何病毒性遗传物质，应用定向进化来改善eVLPS需要开发一种替代策略来编码标记eVLP突变的身份。这篇报告中，研究人员设想在eVLP包装的货物中插入一段带条码（barcoded）的sgRNA，在无DNA的 eVLP包装货物中作为每个eVLP突变体的唯一标识，这样经过所需属性的筛选后，排名靠前的幸存者就可以通过唯一标识而被识别出来。这种针对eVLP的定向实验室进化条码策略原则上可用于不同的eVLP组分，比如衣壳、包膜和其他结构蛋白，只要把条码sgRNA和进化目标放在一起，能够发现具有改进特性的eVLP突变体。

作者首先验证带条码的sgRNA与功能性eVLP生产兼容。他们将15个碱基的条码序列插入sgRNA骨架的四核苷酸环（ tetraloop）——此位置和插入长度不会影响sgRNA功能。他们用此前开发的第四代（v4）碱基编辑器(BE)- eVLP——包装了一个活性腺嘌呤BE (ABE) RNP货物，进行验证实验。通过将4个质粒——分别编码Gag-ABE融合、Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）Gag-Pro-Pol多蛋白（其中含有所需的病毒蛋白酶和其他结构性成分）、水疱性口炎病毒G（(VsV-G)）包膜蛋白、和指导靶标碱基编辑的sgRNA——共转染到产生细胞中制备标准v4 BE-eVLPs。

作者制备了含有标准和四种分别带不同条码sgRNA的v4 eVLP，并通过测量它们转导HEK293T细胞后的碱基编辑效率（BCL11A位点）进行了比较。他们发现具有不同条码sgRNA的eVLP具有相当的效力，均与标准eVLP相当。这说明他们“加塞”条码的sgRNA能够与功能性eVLP生产兼容，基本不影响。此外，缺乏Gag-ABE融合的eVLP比标准v4 eVLP封装的sgRNA少216倍。

然后作者验证了带条码的eVLPS可以用来区分具有不同功能性质的EVLP突变体。为此进行了两个模拟筛选：一个是包装货物的eVLP生产选择，另一个是HK293T细胞的EVLP转导选择。结果表明，带条码的sgRNA可以用于标记不同的eVLP突变体，并且经过选择后富集的条码可以识别出适应性增强的突变体，验证了条码化eVLP进化系统的关键，并确立了一个用于使用条码sgRNA来识别具有所需属性的eVLP突变体的框架。

V5

接下来，作者应用条码化eVLP进化系统来选择具有改进性能的eVLP衣壳。V4 eVLPS中使用的衣壳蛋白与野生型MMLV中使用的衣壳蛋白相同——这个在自然界中已经进化成为包装病毒基因组的最佳选择。而对于包装大型的非本土蛋白货物，这可能不是最好的。作者假设改造eVLP衣壳蛋白内部或许能够优化ABE RNP货物包装，而不是病毒基因组包装，可以提高eVLP的性能，包括每个颗粒的效力、每个颗粒包装的货物分子数、总体颗粒产量或滴度和颗粒稳定性。

为此，作者生成了一个带条码的eVLP衣壳文库——包含了Gag-ABE货物中MMLV Gag蛋白衣壳和核衣壳结构域的3762个单残基突变体，并实施了一个库建设策略以保存条码和突变体之间的联系，以便对选择结果进行解码。用这个条码库构建条码eVLP生产细胞库，生产eVLP，并纯化得到的衣壳突变体文库。

条码化eVLP衣壳文库分别进行两次筛选，以提高生产细胞的产量和对HEK293T细胞的转导。

随后，分离出eVLP包装的sgRNA，并对经过产量筛选出的条码进行测序。对每个条码序列的eVLP产物的富集程度进行了评估，与标准eVLP衣壳相比，鉴定出eVLP富集程度更高的条码。文库中约8%的衣壳突变体比标准eVLP衣壳具有更高的产量富集。由于大多数衣壳突变很可能会破坏小心的组织过程，因此筛选出比标准衣壳更高效的突变是少见的。

HEK293T细胞用纯化的条码化eVLP衣壳文库孵育。6小时后，分离转导到靶细胞的sgRNA，计算每个条码序列的eVLP转导富集。

只有0.7%的衣壳突变体的平均转导富集度高于标准v4 eVLP衣壳。衣壳突变体更有可能提高eVLP生产或RNP货物包装，但很少提高类病毒颗粒稳定性、进入细胞或其他影响转导的特性。

根据生产效率或转导选择富集，选择了几个突变体进行进一步分析。优先考虑那些能提高一种特性而不损害另一种特性的突变体。

在Gag-ABE构建体中引入衣壳突变并没有增加效力。研究人员评估了具有Q226P突变的Gag-ABE构建体的衣壳突变的效力，该突变在Gag-Pro-Pol构建体的生产选择中最为丰富（GagQ226P-Pro-Pol）。与V4 eVLP相比，不同的衣壳突变体将BE的递送能力提高了三倍。C507V、C507F、A505W、D502Q、R501I 5个突变的效价最高；然而，一个突变组合GagC507V-ABE与GagQ226P-Pro-Pol的效力提高了3.7倍，被指定为第五代（v5）BE - eVLP。

比较了V4和V5 BE- eVLP的效价，结果表明V5的碱基编辑效率显著高于V4。