人工合成新冠病毒-2020-5-7

数日来，新冠病毒确诊数稳中有降，疫情猖狂的势头得到了有效遏制。但是，要彻底地阻断新冠病毒的进一步扩散，疫苗和药物将是最可靠的防护盾。加紧新冠病毒相关研究，活病毒的获取十分关键。

5月4日，Nature发表了来自瑞士伯尔尼大学团队的基于反向遗传学的病毒构建策略，无需从患者体内提取病毒，利用病毒核酸序列，即可根据需要改造具有活性的新冠病毒。

4月13日，Cell旗下的《Cell Host & Microbe》杂志发表了美国微生物科学院院士史佩勇教授团队构建的SARS-CoV-2病毒版本。史教授团队的文章是3月22日被接受的，瑞士团队的文章更早，于2月21日就发表在了预发布平台。

两篇都是病毒反向遗传学研究，但是处理方法不大一样

史教授团队用的是酶切连接：

首先从Vero E6细胞的第四代病毒中提取病毒RNA，作为RT-PCR模板制作cDNA片段，构建覆盖病毒整个基因组的7个连续的cDNA片段，一部分通过RT-PCR制备，另一部分通过化学合成，将cDNA片段分别克隆到质粒载体中，为了方便定向组装，每段cDNA两侧都有一个II类限制性内切酶位点，识别非对称DNA序列，切割产生独特的内聚悬链，经酶切后，再将7段纯化的cDNA片段在体外定向连接，合成完整基因组长度的cDNA。最后体外转录成RNA链，再电转入细胞，从上清液中获得具有感染性的病毒颗粒。每个片段独特的内聚端可以确保7个片段的单向、无缝组装，以及内切酶位点的丢失。

瑞士伯尔尼大学的蒂尔和约雷斯团队利用的是不依赖限制酶酶切位点的同源重组法：

这种方法名为转化偶联重组技术（transformation-associated recombination, TAR)。首先将病毒基因组拆成12段长0.5-3.4 kbp具有重叠末端序列的DNA片段，并引入GFP，利用酵母人工染色体的同源重组系统，使cDNA片段在酵母细胞中重组成完整的基因序列。之后，在体外用T7 RNA聚合酶将cDNA转录成为有感染性的病毒RNA。通过电穿孔将RNA导入VeroE6细胞，被感染的细胞能够发出荧光。

为了避免“人工制造新冠病毒”的嫌疑，实验室还给出了他们合成病毒的时间轴，在1月10日中国公布全基因组后4天才下的合成订单，但是到2月4日只收到了12条DNA，1月28日澳大利亚分离到了活病毒，于是他们在2月5日向其索要病毒RNA，最终于2月8日利用酵母组装出包含全部病毒基因组的cDNA，体外RNA转录后将RNA电转入细胞，通过噬斑和荧光显微镜观察确认病毒复活成功。也就是说，这篇文章没有用到原代病毒培养，病毒基因组的获得也跟史教授一样，一部分来自公司化学合成，一部分来自反转录PCR。

但是这篇Nature文章的重点是作者单位展示了一个基于酵母的合成基因组学平台，利用这套技术他们已经合成过各种RNA病毒，包括冠状病毒、黄病毒和副粘病毒等。TAR克隆系统的主要优点是基因组容量较大，可以稳定地复制更长的DNA，而且改造或复活速度较快，在克隆效率方面优于大肠杆菌为载体的系统。

但是，值得注意的是这种合成生物学也是一把双刃剑，一方面可大量提供具有感染性的病毒，无需接触临床样本，能加快新疫苗和药物的研发；另一方面，一旦发生泄漏，后患无穷。因此这类研究必须受到有关机构的严格监管，才能供医疗和研究机构使用。