上海交大陆钰明课题组建立大幅增强基因表达的通用解决方案


  发布日期: 2024年08月03日

  来源:上海交大 新闻学术网

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上海交大陆钰明课题组建立大幅增强基因表达的通用解决方案

如何通过原位精准编辑大幅增强目标基因的表达?2024年7月23日,上海交通大学陆钰明教授课题组联合南方科技大学朱健康院士团队,在Molecular Plant在线发表了题为“Efficient and multiplex gene upregulation in plants through CRISPR/Cas-mediated knock-in of enhancers”的研究论文。该研究将全新的全基因组增强子挖掘技术(STEM技术)与基因敲入技术结合,在植物上建立了一种可通用(30+各类基因的激活)、可设计(3-1000倍增强)、可遗传(>T3代的验证)的基因激活技术。通过一次敲入实验,该技术进一步实现了对整个NMN代谢通路多达4个基因的同时激活,首次将植物内源性NMN含量提升了2-3倍,为基因过表达提供了一种替代转基因的通用解决方案。

基因表达的精准调控对于物种改良至关重要,通常依赖于转基因技术。随着CRISPR/Cas介导的敲入技术的发展,精确地在植物基因组中插入序列成为可能。如果能够实现有针对性地将增强子插入基因的启动子区域,实现直接增强转录的“原位激活”,则有望克服对转基因的依赖和随机性编辑的局限。但适合精确敲入的短转录增强子(STEs)的短缺限制了其在植物育种中的应用。符合监管政策的短序列、高效的内源性STEs的需求迫切,但目前相关研究非常有限


图1. STEM技术,实现STE的全基因组挖掘

区别于Starr-seq技术,该研究首先开发了一种名为STEM的一种高通量筛选增强子的方法。为了大规模地从物种基因组中筛选出具有不同调控能力的增强子,该研究提供了一种含条形码载体系统,将每个条形码与候选增强子元件一一对应,通过测量条形码的丰度,获得候选增强子元件的激活倍数。基于STEM,通过分析水稻基因组中关键候选基因的启动子区域,研究团队鉴定了11610个候选STEs,并利用条形码介导的RNA-seq分析,成功鉴定了122个来自病毒及水稻的短增强子,其中来自病毒的增强子最高能够达到1000倍的激活效果,来自水稻内源的增强子最高能够达到66.6倍的激活效果,其中最短的增强子长度为40bp,大多数集中在100bp。该研究通过体外实验确定了STE插入的最佳位置,发现越接近转录起始位点(TSS),增强效果越强。在水稻多个不同基因中进行的目标敲入实验中,实现了高达176倍和869.1倍的基因表达上调,且该上调效果在多代中稳定遗传。

图2. 高达1000倍的原位激活

此外,为了验证梯度激活的可行性,该研究选择了四个具有不同激活能力的STEs,包括来自病毒的STEvs011和STEvs007,以及水稻衍生的STEos026和STEos045。通过将这些STEs的供体DNA片段混合并转化水稻愈伤组织,研究人员成功获得了不同STEs插入的水稻T0代植株,并观察到EUI和RFT1基因表达的梯度上调。与此同时,研究人员还探讨了同时激活多个基因的可能性。以烟酰胺单核苷酸(NMN)生物合成途径为例,研究人员设计了六个相关基因的sgRNA位点,并构建了相应的CRISPR/Cas9质粒。通过单次转化,研究人员成功实现了多达四个基因的同时激活,并显著增强了NMN代谢途径。

该研究通过开发一种创新的全基因组筛选方法STEM,实现了短转录增强子(STEs)的高效筛选,并在水稻中成功应用了“原位激活”技术。此外,该研究证实了通过“原位激活”技术实现的基因上调效果在多代植物中具有稳定的遗传性,解决了传统转基因技术中常见的代际不稳定性问题,通过使用不同STEs实现了目标基因表达的梯度调控,通过单次转化实现多个基因的同时激活,这为复杂性状的精细调控和改良提供了新的可能性。该工作强调了对高效、短序列、具有特定活性的内源性STEs的进一步研究的必要性。未来通过探索STEs的时空特异性表达调控机制,将为植物遗传改良提供更为精确的工具。鉴于基因组编辑技术相较于传统转基因技术在监管政策上的优势,该研究为符合政策导向的作物改良提供了新的思路。

图3. 可设计、可遗传、多基因的原位激活

姚琦博士、沈润东博士和邵扬博士为共同第一作者,陆钰明教授和朱健康院士为本文通讯作者,田益夫博士、韩沛津博士、张学宁博士也参与了该研究。该研究得到了科技部重点研发计划青年项目、上海市农业科技创新项目和国家自然科学基金项目资助。

值得注意的是,陆钰明课题组也在今年5月份在New Phytologist发表了题为“In-locus gene silencing in plants using genome editing”的研究论文,成功开发了“原位沉默”技术。通过在5’UTR区敲入一种多功能调控元件ATGE,该方法可通过一次敲入实验,获得具有不同敲低程度的基因编辑材料,从而建立了一种高效率、可遗传、非转基因的新型基因沉默技术。结合该团队独特的敲入技术(Nature Biotechnology 38:1402),其已成功建立了完全自主的基因编辑育种体系,实现了低至10%、高达1000倍,可通用、可设计、可遗传的基因原位调控。

论文链接:https://doi.org/10.1016/j.molp.2024.07.009

农业与生物学院
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