Nature Biotechnology：单细胞中ACE-ing蛋白检测

(波士顿)自20世纪50年代以来，研究人员一直使用华莱士·库尔特发明的著名方法“流式细胞术”来表征研究和人类个体血液样本中不同类型的免疫细胞。这使得人们对免疫细胞的发育有了更深入的了解，也为评估人类健康和诊断各种血癌提供了新的方法。后来，流式细胞术也应用于其他细胞类型。

在传统的流式细胞术中，用与荧光探针相连的抗体分子检测细胞表面和细胞内蛋白质。然而，在提供单细胞灵敏度的同时，这种方法在检测多种蛋白质时受到荧光团数量的限制，这些荧光团可以在整个荧光灯光谱中清楚地区分。2009年，“大规模细胞术”的出现，使人们能够同时对单个细胞中的50种蛋白质进行定量分析，并对细胞的特性和生理状态进行更细致的分析。在大规模细胞术中，抗体与金属元素的非放射性同位素相关联。这些同位素可以根据它们的质量在质量细胞仪的不同通道中进行量化。然而，与流式细胞术和荧光显微镜相比，质量细胞术及其同类“图像质量细胞术”(IMC)用于在完整组织切片中可视化细胞蛋白，其代价是灵敏度降低。

现在，又过了15年，由哈佛大学Wyss研究所领导的一项研究合作，包括麻省理工学院和多伦多大学的研究人员，已经开发出一种利用DNA纳米技术显着提高细胞计数和IMC灵敏度的方法。将一种名为“循环延伸放大”(amplification by Cyclic Extension, ACE)的新型信号放大技术应用于与抗体相关的DNA条形码，他们能够将抗体结合金属同位素产生的蛋白质信号放大500倍以上，并同时以高灵敏度检测30多种不同的蛋白质。这种新方法使他们能够定量检测稀有蛋白质，研究复杂的生物组织变化，并研究调节免疫细胞功能的相互连接的蛋白质的整个网络如何对刺激和病理条件作出反应。应用于IMC, ACE还可以在组织学切片上识别细胞类型和组织区室，以及与多囊肾病病理相关的组织变化。研究结果发表在《自然生物技术》杂志上。

“ACE有助于缩小细胞分析的关键差距:通过提高细胞计数的灵敏度，它使单细胞分析平台同时实现高灵敏度、高复用和高吞吐量。它为研究悬浮液中的单细胞和完整组织提供了高度多路和敏感的方法，可以更深入地了解正常和病理生物过程，”领导这项研究的Wyss研究所核心教师彭银博士说。Yin也是哈佛医学院系统生物系的教授。

更多的DNA，更多的金属同位素，更高的灵敏度

此前，Yin和他在Wyss研究所的团队已经开发了多种dna成像技术，可以在单分子水平上以超高分辨率揭示细胞的内部运作，或者通过在单个组织切片中可视化许多不同的RNA和蛋白质分子。但是用这些方法产生的DNA结构没有足够的弹性来承受细胞计数术中使用的相对恶劣的条件。

“与传统的大规模细胞术相比，ACE允许研究人员将抗体分子与大量增加的金属同位素相关联，从而解决了目前大规模细胞术的敏感性问题。这极大地促进了广泛的低丰度蛋白质的量化，使用以前的单细胞方法一直具有挑战性，”共同第一作者、尹氏小组的博士后伦晓康博士说。伦与共同第一作者盛宽伟博士合作完成了该项目，盛宽伟博士最初开发了ACE用于其他应用，包括多路复用成像，他也是尹的博士后研究员。盛说:“受到我们之前在引物延伸反应上的工作的启发，该反应可以创建线性DNA串联体(同一DNA序列的多个拷贝串联在一起)，以及通过同步热循环实现扩增的PCR反应，我们发明了ACE，通过可控的热循环在原位合成线性串联体。”

ACE为携带短金属同位素的“检测链”创建了一个具有多个结合位点的支架。此外，通过支架链的分支合成，研究人员可以进一步提高该方法检测稀有蛋白质的灵敏度。线性ACE平均提供13倍的信号放大，而分支ACE允许最初未放大的信号增加500倍以上。为了稳定整个ACE序列复合物，并在质量细胞分析中保持其完整，他们用化学交联剂将支架和添加的检测链之间形成的短双链交联。“按照这个配方，我们设计了一个包含33个可区分的(同源)ACE序列的面板，这些序列的合成不会相互干扰，并将其应用于三种完全不同类型的分析，”Sheng说，他也是Yin团队的博士后研究员。

工作中的ACE

研究小组首先利用ACE研究了上皮细胞向间充质细胞和再向上皮细胞的转变。上皮-间充质转化(EMTs)和间充质-上皮转化(METs)发生在胚胎发育过程中，但当肿瘤发生侵袭性和转移性时，前者也会重新发生。通过分析单个小鼠乳腺癌细胞在28天内从上皮细胞到间充质细胞再到间充质细胞的转变过程中的32种上皮和间充质标记物、信号分子和罕见的转录因子，并对结果进行计算分析，他们能够对这两个过程有新的了解。“ACE使我们能够同时分析低丰度转录因子水平与反映细胞生理和单细胞信号状态的标记。这使得我们对EMT和MET中的分子程序是如何由关键转录因子(包括Zeb-1和Snail/Slug)的增加和减少所驱动的有了更详细的了解。”

在他们的第二个例子中，他们放大到单个T细胞的内部工作。刺激其表面的t细胞受体(TCR)分子导致细胞内信号蛋白复杂网络的激活。由于T细胞体积小，在单细胞分辨率上分析这些信号反应一直很困难。这个网络中的单个蛋白质被磷酸残基激活，磷酸残基被其他通常称为激酶的网络蛋白质附着在它们上面。这些被激活的网络蛋白中的许多继续磷酸化网络中的其他蛋白。这最终会导致t细胞行为的改变，例如对病原体或癌细胞的行为。研究人员将ACE应用于一组30种抗体，这些抗体与应激、炎症、细胞增殖和其他反应中具有功能的tcr网络蛋白中的磷酸化基元特异性结合。“使用ace增强的质量细胞分析，我们捕获了个体原代人T细胞中动态变化的TCR网络的定量快照。这使我们能够研究特定t细胞激活事件的时间和持续时间的单细胞变化，并揭示细胞外信号如何从基态激活网络”。

研究小组使用同样的ace增强抗体小组来研究一种被称为“损伤性t细胞麻痹”的现象。T细胞在其环境中受到损伤，例如在重大外科手术中引起的组织损伤，通常会产生免疫抑制。为了开始了解TCR网络是如何导致这种情况的，Yin的小组与合著者Michael Yaffe医学博士合作，Michael Yaffe是麻省理工学院David H. Koch科学教授和生物学和生物工程教授，他对组织损伤部位周围的微环境如何抑制免疫系统有浓厚的兴趣。Yaffe向研究小组提供了从接受手术的患者身上获得的“术后引流液”(POF)样本。用POFs和tcr刺激T细胞，使研究人员能够分离出导致单个T细胞停止分裂并耗尽的不同网络变化。

最后，他们研究了ACE在利用IMC对人体肾脏组织切片进行蛋白质空间分析方面的应用。由于肾脏组织本身具有很强的荧光性，因此荧光显微镜很难对其进行分析，而传统的IMC则缺乏灵敏度。研究人员开发了一个由20种ace增强抗体组成的小组，用于各种肾脏标志物，并用它来检查来自多囊肾病患者的肾皮质切片。他们与合著者、加拿大多伦多大学教授、多路成像专家Hartland Jackson博士合作采用了这种方法，使他们能够识别肾脏近端和远端小管、收集管和血液过滤肾小球内不同的细胞类型及其组织。伦说:“我们发现了细胞和组织组织的新的疾病特异性特征，并发现与肾脏疾病相关的干细胞标记物巢蛋白在肾小球中的表达非常不均匀。”“这可能意味着组织的不同部分可能同时经历不同的病理阶段。”

“彭银的团队和他们的合作者开发的这种新的细胞计数方法再次显示了利用DNA纳米技术来增强与临床护理高度相关的现有技术的力量，并使其具有更高的灵敏度和特异性。“这种相对简单的方法将导致对健康和疾病期间细胞，组织和器官功能的全新见解，”共同资深作者和Wyss创始董事Donald Ingber医学博士说。