EGFR基因突变，基因编辑技术揭示癌症耐药性途径

通过结合先进的基因编辑技术，科学家们确定了影响肺癌肿瘤生长和耐药性的关键突变，为量身定制的癌症治疗提供了新的途径。

在最近发表在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上的一项研究中，瑞士的研究人员使用碱基和引物编辑技术，在多种细胞系（包括癌细胞和非癌细胞）中创建和分析了上皮生长因子受体（EGFR）基因的各种变体，以研究它们对癌症进展和耐药性的影响。他们发现，以前已知的和新的突变都与EGFR激活和药物反应显著相关，证明了该方法的准确性，并揭示了影响肿瘤生长和耐药性机制的新途径。

尽管基因组测序取得了进展，但一些遗传变异仍被归类为不确定意义变异（VUS），使疾病的诊断和治疗复杂化。这在非小细胞肺癌（NSCLC）相关的EGFR变异中尤其明显，其中约50%的EGFR变异是VUS。目前的治疗方法，包括靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），对非典型突变的效果较差，导致预后不佳和耐药。新的方法，如多重检测和基于聚类、定期间隔的短回文重复（CRISPR）的筛选，有助于评估变异，但它们目前缺乏分析所有可能突变所需的规模、特异性和准确性。

碱基编辑技术提高了准确性，但受到意外编辑和限制性突变类型的限制。Prime编辑是一种更先进的方法，可以精确地引入多种突变，包括插入和缺失，为评估VUS的致病性提供了一种高通量方法，并为个性化癌症治疗开辟了新的途径。在本研究中，研究人员使用碱基和引物编辑的组合对EGFR基因的整个编码序列进行高分辨率突变扫描，以鉴定与各种细胞类型的癌症进展和耐药性相关的已知和新的突变。

研究人员使用依赖野生型EGFR生长的MCF10A细胞来评估EGFR变异的致病性。他们在EGFR中引入了特异性突变，通过慢病毒传递，使用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（BE3.9max和ABE8e）促进激活，使用1,496个单导核糖核酸（sgRNAs）库靶向所有EGFR外显子和关键调控位点。在编辑和剥夺EGF之后，研究人员对sgRNAs进行测序，以鉴定影响细胞活力的突变。在后续筛选中，他们通过用吉非替尼或奥西替尼治疗MCF10A细胞，并分析sgRNA文库以识别新的耐药变体，评估了与耐药相关的EGFR突变。

为了扩大他们的突变筛选，研究人员还使用了启动编辑来引入更广泛的EGFR突变，包括来自ClinVar和COSMIC数据库的突变。他们设计了没有MLH1基因的MCF10A细胞，以提高引物编辑效率，并通过慢病毒载体传递了针对14个已知和重要的EGFR突变的引物编辑指导RNA （pegRNAs）。在pegrna中包含同义突变使研究人员能够检查它们对编辑效率的影响。

在MCF10A细胞中，这两种碱基编辑器的编辑效率都达到了95-97%，随着时间的推移，突变会积累，一些等位基因会出现多次编辑。筛选发现了基本sgRNAs的缺失，证实了筛选检测损害细胞活力的突变的能力。值得注意的是，EGFR中影响剪接位点的突变、无义突变和错义突变与功能丧失效应相关。

筛选显示已知的和几种新的EGFR突变与耐药性有关，特别是在EGFR酪氨酸激酶结构域的atp结合口袋中。对于吉非替尼，已知的突变如Thr790Met，以及先前未表征的结合袋附近突变，包括Val726、Met766和Thr854，被证实具有耐药性。对于奥西替尼，Thr790Ala、Gln791Arg和Val845Ala等突变以及c端结构域突变富集，提示不同的耐药机制。这些发现强调了EGFR中特定的分子内相互作用和结构变化有助于抵抗各种TKIs。

碱基编辑还揭示了影响药物敏感性的突变的微妙观点。例如，Val845Ala突变对奥西替尼耐药，但对吉非替尼敏感，而其他突变，如Lys852Glu，对两种药物都有耐药性。继发性突变，如Thr790Met，进一步增强了egfr突变PC-9细胞的耐药性。引体编辑引入了ClinVar和COSMIC中列出的近92%的EGFR变异，确定了新的突变，包括外显子20插入和与耐药性相关的细胞外结构域突变。

该研究证明了多模态精确碱基和引物编辑的优势，并为EGFR激活和耐药性提供了见解。然而，它依赖于egf独立增殖作为EGFR信号的代理，并且没有分析受体相互作用或杂合效应，因此受到限制。未来的研究可以利用额外的细胞模型和工程细胞系来解决这些问题。

本研究开发了一个强大的，高分辨率的突变扫描框架，结合了碱基和起始编辑的能力来分析与耐药性和肿瘤生长有关的遗传变异。将这种方法扩展到更广泛的遗传元素和细胞模型，包括原代人类细胞，将有助于阐明各种遗传变异的临床相关性，并支持个性化的癌症治疗。